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Schule > Biologie > Genetik > Einführung in die Genetik - ausführliche Zusammenfassung

Zusammenfassung Genetik

I DNA als Träger der genetischen Information
II Fluss der genetischen Information
III Escherichia Coli
IV Homologe Rekombination
V Plasmide
VI Bakteriophagen
VII Genexpression
VIII Restriktion / Modifikation
IX Glossar

I DNA als Träger der genetischen Information

• Welche Beobachtungen und Experimente haben gezeigt, dass DNA der Träger der Erbinformation ist?
1. Experiment von F. Griffith (1928): Aus toten, virulenten Erregern von Lungenenzündung werden Eigenschaften auf lebende, nicht virulente Bakterien, übertragen, so dass dieser Stamm ebenfalls Lungenentzündung verursacht.

2. Experiment von O. Avery (1944): Zerlegung der toten Erreger in Lipide, Proteine, Kohlenhydrate, RNA und DNA. Nachweis dass nur die Übertragung der DNA den Stamm virulent macht.

3. Arthur Hershey & Martha Chase (1952): Avery wird nicht geglaubt, da die DNA nur 4 und die Aminosäuren 20 unterschiedliche Bausteine haben. Hersey/Chase zeigen einerseits mit radiokativen Aminosäuren (S35, Schwefel kommt in der DNA nicht vor) und anderseits mit radioktiven DNA (P32, Phospor kommt in den Aminosäuren nicht vor) an Phagen, dass die Radioaktivität in Form von Phosphor den Wirtsbakterien bleibt, also in der DNA liegt.

• Worauf beruht die Tatsache, dass der A+T resp. G+C Gehalt der DNA verschiedener Organismen variert, während der Gehalt an Purin- und Pyrimidin-Basen immer 50% beträgt?
Auf Grund der konstanten Distanz zwischen den DNA-Rückgraten bindet immer ein 2-ringiges Purin(A,G) mit einem 1-ringigen Pyrimidin(G,C). Welches der beiden Basenpaare verwendet wird, differiert hingegen je nach Organismus.

• Was versteht man unter Komplementarität zweier DNA Stränge? Was unter antiparallelen DNA Strängen?
1. Komplementarität bedeutet, dass jeder Strang wieder als Matrize für ein Gegenstück dienen kann und damit kann sich jeder Teilstrang selbständig zu einer identischen Kopie der ursprünglichen DNA ergänzen.

2. Damit nicht ein Stang nach der Replikation spiegelverkehrt ist, muss immer ein 5’ auf ein 3'-Ende des anderen Strangs zuliegen kommen.

• Unterschiede zwischen DNA und RNA.
1. RNA enthält Uracil, DNA Thymin, d.h. am C-5 Atom eine Methylgruppe statt ein
H-Atom.

2. RNA enthält als Zucker eine Ribose, DNA eine Desoxiribose, d.h. am C-2’ Atom nur ein H-Atom statt einer Hydroxygruppe.

• Was haben Watson und Crick aus ihrem Doppelhelix-Modell im Bezug auf die DNA-Verdoppelung (Replikation) vorausgesagt?
1. Die DNA-Doppelhelix muss für die Replikation aufgetrennt werden.

2. Die Base Adenin paart sich mit Thymin und Guanin mit Cytosin, anders passen die Wasserstoffbrücken gar nicht zusammen oder zuminst kann der gleichmässige Abstand von 20nm kann nicht eingehalten werden.

3. Mutationen durch Einbau von tautomeren Basen und daraus folgender Falschpaarung.

• Grössenordnung von Bakteriophagen- und Bakteriengenom in Basenpaaren/Genen? ca. 0.15 cm mit ∼4 Mio Basenpaaren und 1000-5000 Genen.

• Beschreiben Sie die Tertiärstruktur eines bakteriellen Chromosoms.
Kondensierte Schleifenstruktur mit superhelicaler Aufwindung.

• Beschreiben Sie Experimente, die gezeigt haben, dass bakterielle Chromosomen in der Regel zirkulär sind und bidirektionell repliziert werden.
J. Cairns (1963): "Θ-Figur"
– Markierung der DNA mit H3-Thymin
– Isolierung der DNA
– Abbild auf einem strahlenempfindlichen Film (Audiogramm)
– schwach markierte Chromosomen werden während der Replikation in stark markierte Nährlösung gelegt. Damit wird die Bewegung der Replikationsgabel sichtbar.

• Was versteht man unter semikonservativer Replikation und wie wurde diese nachgewiesen?
– Jeder Strang der ursprünglichen DNA liegt nach der Replikation in einer der beiden
Tochterzellen.
– M. Meselson & F. Stahl (1958): E. Coli werden in schwerem Stickstoff (N15) gezüchtet und anschliessend in normalem N14-Stickstoff vermehrt. Anschliessend wird bei jeder Generation die DNA isoliert und das Verhältnis von N14 zu N15 verglichen. Dabei zeigt sich, dass der Anteil hybrider DNA mit einer Zweierpotenz pro Generation abnimmt. (1 → 1 → 1 → 1 )
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• Auf welcher molekularen Tatsache beruht die Beobachtung, dass die DNA-Neusynthese immer in 5 ->3 Richtung erfolgt?
Die exotherme Hydrolyse des Nucleotid-Triphosphates kann an die endotherme Synthese der kovalenten Bindung zwischen dem 3’- Ende und dem am 5’-C-Atom hängenden Phospat des herangeführeten Nucleotids gekoppelt werden. Wird das Nucleotid an das 5’-Ende herangeführt, kann zwar das Diphosphat durch Hydrolyse abgespalten werden, aber die gewonnene Energie verpufft ungenutzt, da die Bindung in diesem Fall am 3’-C-Atom erfolgen müsste.

• Welche Folgen hat dies für den DNA-Replikationsmechanismus?
– nur der Leadingstrand kann kontinuierlich durch Polymerase III Enzyme synthetisiert werden.
– Der Laggingstrand wird in kurzen Stücken (Okazaki-Fragmenten), initialisiert durch RNA-Primer aufgebaut.
– Die Okazakifragmente werden durch Polymerase I synthetisiert und durch Ligasen verbunden.

• Welche Proteine sind notwendig für die Initiation und Elongation der Replikation und welches ist ihre jeweilige Funktion?
1. Initiation
– dnaA markiert den OriC
– Helicase spaltet die beiden DNA-Strange auf

2. Elongation
– SSB Singlestranded binding protein stabilisiert die offenliegenden Einzelstränge
– Primase synthetisiert auf dem Laggingstrand die RNA-Primer, da die Polymerase nur ansetzen aber nicht initialisieren kann.
– Polymerase III synthetisiert den Leadingstrand
– Die Gyrase entspannt die DNA vor der Replikationsgabel durch Entfernen der
Überspannung.
– Polymerase I synthetisiert auf dem Laggingstrand die Okazakifragmente
– Ligase verbindet die Okazakifragmente
– Exonuklease korrigiert Fehler

• Welche Eigenschaften der DNA-Polymerase III tragen bei zu der tiefen Fehlerrate des Replikationsprozesses?
Die integrierte Exonuklease entfernt falsch eingefügte Basenpaare. Die SSB markieren dabei den Matrizenstrang, damit die Exonuklease weiss, welches Nucleotid das falsche ist.

• Erklären Sie das Prinzip der Polymerase-Ketten-Reaktion und jenes der DNA-Sequenzanalyse nach Sanger.
1. Polymerase-Ketten-Reaktion: Wird eingesetzt zur Vervielfachung einer DNA-Sequenz deren Primer bekannt und verfügbar sind. Die DNA wird durch Hitze (94◦) in die beiden Einzelstränge gespalten. Anschliessend wird auf 50◦ abgekühlt, damit sich die bekannten Primer anlagern. Zuletzt wird je nach GC-Gehalt auf die für die Polymerase (∼ 72◦) ideale Temperatur erhöht und die Sequenz repliziert. Die Polymerase wird aus bitzeresistenden Bakterien gewonnen. Dieser Zyklus wird wiederholt, bis sich genügend DNA angesammelt hat.

2. DNA-Sequenzanalyse nach Sanger: Durch Beifügen von radioaktiv markierten Dideoxynukleotiden werden Abbrüche bei der Polymerase provoziert, da die Hydroxygruppe am *’-C-Atom fehlt. Diese Abbrüche erfolgen zufällig je nach Mischverhältnis von Deoxy- und Dideoxynukleotiden. Dies wird in getrennten Versuchen für alle vier Nucleotide durchgeführt und mittels Gelelektrophorese sichtbar gemacht.

II Fluss der genetischen Information

• Wie unterscheidet sich die RNA-Polymerase von der DNA-Polymerase und welche Eigenschaften teilen sich diese beiden Enzyme?
– Die RNA-Polymerase kann eine neue Polynucleotidkette mit einem 5’-Ende starten.
– RNA Polymerase baut Uracil anstatt Thymin ein
– Die DNA-Polymerase repliziert DNA und die RNA-Polymerase transkribiert RNA. Dabei arbeitet die DNA-Polymerase wesentlich genauer, da sich ein Fehler in der Replikation auf die kommenden Generationen vererbt.
– Die DNA-Polymerase arbeitet an einem einzelnen DNA-Strang, während die RNA-Polymerase einen Doppelstrang über ca. 17 Basenpaare auftrennt und ein ca. 12 Basenpaare langes RNA/DNA-Hybridmolekül bildet.
– Beide Polymerasen können Nucleotide zu Ketten synthetisieren, wobei der Zucker bei DNA eine Desoxyribose ist um Gegensatz zur Ribbose in der RNA am 2’-C-Atom statt einer Hydroxylgruppe nur ein H-Atom hat.

• Welche "Signale" in der DNA sind notwendig für eine exakte Initiation und Termination der Transkription?
– Die Transkription beginnt bei einem Promotor. Die RNA-Polymerase erkennt diesen am Sigma-Faktor. Der Promotorbereich liegt -10 bis -35 Basenpaare vor dem Start der Gensequenz.
– Die Transkription endet mit einem Terminator. Dieser wird oft aus einer Schleife in der DNA, gebildet durch zwei komplementäre Sequenzen gefolgt von einigen A oder T. Diese sind schwächer bindend, da sie nur 2 H-Brücken aufweisen.

• Welches sind die drei Gruppen von RNA Molekülen in der Zelle, wodurch unterscheiden sie sich voneinander und welches sind ihre spezifischen Funktionen während der Expression genetischer Information?
1. ribosonale RNA (rRNA) Bildet die Ribosomen und macht ca. 80% der RNA in der Zelle aus.

2. Transfer-RNA (tRNA) kleine RNA-Moleküle, welche bei der Proteinsynthese als Adapter zwischen den Aminosäuren und der mRNA verwendet werden. Machen ca. 15% der RNA in der Zelle aus. Sie hat Kleeblattform mit einem Arm als Anticodon zum Aufsetzen auf der mRNA und einem Arm um die Aminosäure hinzuführen.

3. Messenger-RNA (mRNA) Eigentliche codierende RNA, welche in der Proteinsynthese abgelesen wird. Sie macht etwa 5% aller RNA aus.

• Die Aminoacyl-tRNA Synthetasen sind die Schlüsselenzyme beim Umschreiben des genetischen Codes in Aminosäuren. Weshalb?
Die Aminoacyl-tRNA Synthetasen koppeln die Aminosäuren an die tRNA. Es gibt deshalb 20 verschiedene dieser Enzyme. Ohne die Koppelung wäre eine Paarung mit mRNA nicht möglich, sie sichern die Genauigkeit der Translation.

• Weshalb gibt es in einer bakteriellen Zelle in der Regel weniger als 61 verschiedene tRNAs?
Wegen dem degenerierten Code muss die dritte Base des Anticodon-Arm nicht so strikt mit der Messenger-RNA paaren, da die dritte Base oft keine Rolle mehr spielt und für dieselbe Aminosäure codiert.

• Wie erkennt ein Ribosom den Anfang eines Gens?
Am Startcodon AUG, seltener GUG. Damit AUG als Startcodon von der Aminosäure Methionin (MET), welche auch mit AUG codiert unterschieden werden kann, existieren zwei verschiedene tRNA’s.

• Wie wirken Antibiotika und wie können sich Mikroorganismen gegen die Wirkung von Antibiotika schützen?
1. Wirkung auf:
– Transkription (z.B. RNA-Polymerase)
– Translation(z.B. Aminoacyl-tRNA Synthetasen)
– Zellwandbiosynthese
Unterscheiden sich alle bei Prokaryoten und Eukaryoten.

2. Schutz:
– Pumpen, welche das Antibiotika wieder hinauspumpen
– Modifikation des Antibiotikums, dass es nicht mehr in die Translation oder
Transkription eingreifen kann
– Modifikation der Zielstruktur, dass das Antibiotikum diese nicht mehr findet.
– Zerstörung und Abbau des Antibiotikums

• Welches sind die Voraussetzungen für das Auftreten und die Verbreitung von Antibiotikaresistenten Bakterien?
Die Lebensbedingungen müssen so sein, dass die Überlebenschancen für die Mutanten um ein vielfaches grösser sind als für den ursprünglichen Wildtyp.

III Escherichia Coli

• Welche molekularen Mechanismen führen zu Veränderungen in der DNA?
– Tautomere Umlagerung (Verschiebung einer Doppelbindung) Cytosin C* in der seltenen Iminoform paart mit Adenin und Thymin T* in der seltenen Enolform paart mit Guanin. Analoges gilt für die Iminoform von Adenin A* ↔ Cytosin und die Enolform von Guanin G* ↔ Thymin.

– Basendesaminierung (Ersatz der Aminogruppe durch ein O-Atom) Sind pH und Temperatur abhängig. Am häufigsten bei Cytosin, welches dadurch zu Uracil wird und in der RNA-Welt nicht mehr von einer korrekten Base unterschieden werden konnte. Deshalb wurde in der DNA-Welt Uracil durch Thymin ersetzt.

• Wie prägen sich Basenveränderungen zu stabilen Mutationen aus?
Wenn sich während dem die Stänge getrennt sind, die Imino- resp. Enolform der Base in die Normalform zurückwandelt, wird sie bei der Replikation mit der falschen Base gepaart. Diesen Fehler kann der Reparaturmechanismus nicht feststellen und die Mutation wird weitervererbt.

• Beschreiben Sie die Konsequenzen von Punktmutationen in einem bestimmten Gen auf die Funktion des betreffenden Genprodukts.
– Stumme Mutation Mutation codiert für die gleiche Aminosäure
– Neutrale Mutation Verändertes Triplett codiert für eine chemisch ähnliche Aminosäure
– Missense Mutation Verändertes Triplett codiert für eine chemisch nicht verwandte Aminosäure
– Nonsense Mutation Verändertes Triplett ist ein STOP Codon

• Was ist der Unterschied zwischen Reversion und Suppression einer Mutation?
– Aus eine Suppression resultiert der gleiche Phänotyp aber ein unterschiedlicher
Genotyp.
– Aus einer Reversion resultiert wieder der ursprüngliche Genotyp.

• Was sind konditionale Mutationen und weshalb sind diese für den Genetiker besonders
interessant?
Mutationen, welche nur bei bestimmten äusseren Bedingungen auftreten wie z.B.
Temperatur oder pH-Wert. Damit kann mit den Umgebungsbedingungen gesteuert
werden, wann sich der Mutant als unterschiedlicher Phänotyp zeigt.

• Welche Mutationsarten erhält man, wenn man eine Bakterienkultur mit folgenden
Mutagenen behandelt: Erklären Sie weshalb.

– Basenanaloge (z.B. 5-Bromouracil):
Wird statt Thymin eingebaut, paart aber mit Guanin statt Adenin, da es wegen der
höheren Elektroneagativität zu Ionenbildung neigt und dehalb die Lage der beiden
restlichen Wasserstoffbrücken besser zu Guanin passen. Daraus resultiert eine
Punktmutation A-T → G-C.

– alkylierende Substanzen (z.B. Ethylmethansulfonat):
Durch Anhängen eine Methylgruppe an das doppeltgebundene O-Atom beim Guanin
entfällt eine Wasserstoffbrücke und das O 6 -Methylguanin paart mit Thymin. Daraus
resultiert eine Punktmutation G-C → A-T.

– UV:
Hochenergetisches UV-Licht von ∼ 300 nm verbindet die C-Atome des Purin- resp.
Pyrimidinringe benachbarter Nukleotide kovalent zu einem Cyclobutylring. Dies tritt
vor allem bei Thymin in Form sogenannter Thymindimere auf und unterbricht die
DNA-Replikation.

• Beschreiben Sie alle Möglichkeiten, die eine Zelle hat, um spontane und induzierte chromosomale Mutationen zu korrigieren.
– Die Alkyltransferasen erkennen und entfernen spezifisch Alkylgruppen. Sie können damit falsche Methylgruppen entfernen.

– Die DNA-Glykosylase entfernt unnatürliche Basen inkl. Uracil aus der DNA. Anschliessend werden durch die Endonuclease Die Zucker und Purin/Pyrimidinreste entfernt. Eine Polymerase setzt ein neues Nucleosit ein und die Ligase verbindet die Bruchstellen.

– Grössere fehlerhafte Abschnitte werden durch die Nuklease herausgeschnitten und von der Polymerase neu synthetisiert. Am Schluss werden die Bruchstellen von der Ligase neu verbunden.

– Nach der Replikation wird der alte Strang an Methylresten erkannt, damit nicht aus Versehen die Matrize verändert wird. Die Methylierung von Adenin in der Sequenz GATC ist natürlich und stört die Basenpaarung nicht. Nach der Replikation ist der neue Strang noch nicht methyliert wodurch die falsche Base einer Fehlpaarung identifiziert wird.

– Die Photolyase kann einen Thymindimer spalten und so direkt reparieren. Das Enzym ist lichabhängig und wirkt deshalb im Dunkeln nicht.

– Die SOS-Antwort hilft der Replikationsgabel über eine DNA-Läsion (z.B. Thymindimer) hinwegzulesen. Dabei leidet jedoch die Genauigkeit der Polymerisierungsreaktion und es treten vermehrt Replikationsfehler auf. Das SOS-System besteht aus mehreren Proteinen, die nur dann von der Zelle hergestellt werden, wenn diese große DNA-Schäden enthält.

IV Homologe Rekombination

• Erklären Sie wie es zu Inversionen, Deletionen, Insertionen oder Duplikationen im Bakteriengenom kommen kann.
Wenn DNA durch horizontalen oder vertikalen Gentransfer aufgenommen wird, kann es bei der homologen Kombination zu Fehlern kommen.
Diese äussern sich als:
– Inversion, wenn bei der Auflösung einer Überkreuzung ein Stück DNA in den falschen Strang eingebaut wird.
– Deletion, wenn ein DNA-Abschnitt verloren geht und abgebaut wird oder selten als Plasmid übrig bleibt.
– Insertion, wenn ein Stück DNA z.B. aus einem Plasmid eingefügt wird. – Duplikation, wenn ein Stück DNA verdoppelt wird.
Beim Falten der DNA kann es zu ortspezifischen Mutationen kommen. Diese äussern sich als:
– Inversion hervorgerufen durch Invertasen z.B. Variation des Flagellin in Salmonella typhimurium.
– Insertion oder Deletion durch Integrase resp. Resolvase (einfügen resp. herauslösen eines Genes)

• Was ist horizontaler Gentransfer und inwiefern spielen homologe Rekombination und Transposition bei diesem eine Rolle?
Übertragung von DNA zwischen Individuen der gleichen oder unterschiedlicher Spezies. Bei gleichen Spezies sind die daraus folgenden Variationen erwünscht, bei unterschiedlicher Spezies handelt es sich in der Regel um ein symbiotisches oder parasitäres Verhältnis.

Unterschieden werde folgende Verfahren:
– Konjugation Übertragung von Plasmiden (Bakterieller Sex)
– Transformation Aufnahme von freier DNA
– Transduktion Übertragung von DNA durch Viren/Phagen • Welches sind die Unterschiede zwischen homologer Rekombination , ortsspezifischer
Rekombination und Transposition?
– Bei der homologen Rekombination werden lange Stücke auf weitern Teilen identischer DNA rekombiniert. In der Regel handelt es sich um DNA derselben Spezies.
– Bei der ortsspezifischen Rekombination werden kurze 10-15 überinstimmende Basenpaare rekombiniert und die Stücke über das Kreuz geschnitten.
– Bei der Transposition springt ein Gen mit oder ohne Replikation an eine andere Stelle.

• Beschreiben Sie wie sich die Proteine RecA und RecBCD am Rekombinationsprozess beteiligen?
1. RecA
– kann einen Einzelstrang und eine Doppelhelix zusammenhalten
– bindet an das Rückgrat der DNA, also nicht sequenzspezifisch
– bindet an die singlestanded DNA
– bindet auf der Länge von 5-6 Nucleotiden
2. RecBCD
– Ist eigentlich eine Helicase für die Lockerung blockierter Replikationsgabeln. Ermöglicht zusammen mit RecA den Start der Polymerase an beiden Enden.

• Beschreiben Sie die Abläufe während dem Austausch zweier DNA Stränge bei der homologen Rekombination (zeichnen!).
Die Stränge laufen übers Kreuz. (Schenkelwanderung, Hollyday-Junction). Je nachdem wie beim zweiten mal geschnitten wird, gibt es einen Patch oder einen Splice.

• Wie gross ist die erkannte Zielstruktur bei der Transposition und wie kommt es zu deren Verdoppelung?
Die Zielstruktur enthält 3-15 Basenpaare. Auf beiden Seiten wird ein Strang geschnitten und mit je einem Strang des Transposons verbunden. Die entstehenden Lücken werden anschliessend mit Polymerase repliziert.

• Welches sind die Unterschiede zwischen replikativer und konservativer Transposition?
Bei der konservativen Transposition verschiebt sich das Transposon(Tn) oder die Insertionssequenz(IS) an eine neue Stelle. Bei der replikativen Transposition wird an die neue Stelle kopiert.

• Erläutern Sie welche Auswirkungen IS-Elemente und Transposons auf eine Bakterienzelle haben können.
– Liegt das Ziel in einem Gen, ist dieses nicht mehr funktionell – Liegt das Ziel unmittelbar vor einem Gen, ändert sich dessen Genexpression – Liegt das Ziel in einer nichtcodierenden Region, hat es keine Auswirkungen

V Plasmide

• Was sind Hfr Stämme und wie wurde mit deren Hilfe die Zirkularität des Bakterienchromosoms nachgewiesen?
Hfr-Stämme haben das fertilitets Plasmid F + ins Chromosom integriert und konjugieren deshalb häufiger als normale Stämme. Durch Abbruch der Konjugation und Untersuchung des Phänotyps der Rezipientenzellen, kann die Reihenfolge der Gene und deren Distanz vom OriT festgestellt werden. Bestehen verschiedene OriT, wird die Zirkularität aus der Reihenfolge sichtbar.

• Was versteht man unter einem breiten Wirtsspektrum eines Plasmids und wie würden Sie ein solches nachweisen?
Je mehr Enzyme ein Plasmid selbst codiert, desto unabhängiger wird es von einem bestimmten Wirt.

• Welche Funktionen braucht es für einen konjugativen DNA-Transfer zwischen zwei Zellen?
Es braucht eine F + Donor und einen F − Rezipient. Der Donor bildet Pili und erkennt damit die F− Nachbarzelle Die Pili binden an die Zelloberfläche und werden eingezogen. Dort bildet sich eine Pore, damit ist der Zell-Zell-Kontakt hergestellt. Am OriT des F-Plasmids entsteht ein Einzelstrangbruch und das 5’-Ende wandert durch die Pore in den Rezipienten. In beiden Zellen findet Replikation statt, im Rezipient diskontinuierlich.

• Erfolgt die Replikation der übertragenen DNA in der Donor Zelle bei der Konjugation kontinuierlich oder diskontinuierlich? Weshalb?
Kontinuierlich, weil der Leadingstrand im Donor bleibt.

• Welche molekulare Mechanismen haben mit grosser Wahrscheinlichkeit zur Entstehung und Verbreitung von R-Plasmiden geführt?
– R-Plasmide codieren alle Proteine, welche für einen Transfer nötig sind.
– Sie enthalten ein oder meherer Antibiotika-Resistenz-Gene
– Antibiotikaresistenzen werden mittels Integrons eingefangen und weiterverbreitet.

• Welche verschiedenen Antibiotika-Resistenzmechanismen kennen Sie?

• Was bedeutet ’Hfr’ und weshalb werden diese Stämme so bezeichnet?
high-frequency-of-replication-Stämme konjugieren mit einer Frequenz 10−1 gegenüber
10−4 − 10−5 Stämmen ohne integrierters Fertilitätsplasmid.

• Was versteht man unter Transformation und was ist deren Bedeutung für
Mikroorganismen?
– Aufnahme freier DNA aus der Umgebung
– Dadurch dass tote Zellen ihre DNA in die Umgebung entlassen, haben lebendige Zellen die Möglichkeit diese aufzunehmen und damit mittels homologer Rekombination eigene defekte DNA-Stücke zu reparieren. (z.B. TT-Dimere)

• Was sind Integrons und welche Rolle spielen sie bei der horizontalen Verbreitung von genetischem Material?
Transposons, welche spezialisiert sind Antibiotika-Resistenz-Gene aufzunehmen.

VI Bakteriophagen

• Wie kann man Bakteriophagen nachweisen?
Eine Mischung von Indikatorbakterien und Phagen wird auf eine Nährlösung gegeben. Wenn das Mischverhältnis klein genug ist, bilden sich Plaqueflecken, dort wo die Bakterien von den Viren lysiert worden sind. (Indikatorrasen)

• Wie beteiligen sich Bakteriophagen am horizontalen Gentransfer?
Sie übertragen zusammen eingebaut in die eigen DNA auch Bakteriengene. Diers Vorgang
heisst Transduktion.

• Welches sind die Unterschiede zwischen genereller und spezieller Transduktion? Wie würde eine rec Mutation (z.B. recA-) die Frequenz der beiden Transduktionswege beeinflussen?

– Generelle Transduktion entsteht durch Verpackungfehler beim Verpacken der Phagen-DNA in die Proteinhülle. Dabei werden irrtümlich Bruchstück der Wirts-DNA mitgegeben, welche in der nächsten Wirtszelle homolog rekombinieren.

– Spezielle Transduktion entsteht durch fehlerhafte Excision (illegitime Rekombination) der Viren-DNA aus dem Wirtschromosom. Diese Phagenpartikel haben eine defekte Integrationsstelle und können nur mit homologer Rekombination oder einen Helferphagen in die Wirts-DNA integrieren.

– recA− bedeutet dass das Protein RecA nicht mehr synthetisiert wird. RecA wirkt als spezifische Protease von CI. somit ist genügend CI vorhanden und dieses wirkt als λ-Repressor. Der Wirt bleibt deshlb länger im lysogenen Stadium.

• Welches sind die Unterschiede zwischen Komplementation und Rekombination bei Phagenkreuzungen? Wie kann man die beiden unterscheiden?
– Rekombination benötigt zwei homologe (zusammenpassende) Stücke DNA. Damit das durch Transduktion übertragene Stück in die Wirts-DAN eingebaut werden kann, müssen zwei Überkreuzungen entstehen.
– Kombination kann auch mit jedem Stück DNA vorkommen und dient in erster Line der Reparatur defekter Gene, solange ein intakter Satz vorhanden ist.

• Was ist gemeint wenn man ein Bakteriophagen-Genom terminal redundant nennt? Wie entsteht terminale Redundanz?
Das Phagen-Genom wird σ-repliziert und in lineare Stücke geteilt, welche am Anfang und Ende wieder zu cirkulärer DNA kombinieren können.

• Weshalb ist ein λ-lysogener E. coli Stamm immun gegen eine Superinfektion durch λ Phagen?
Weil auf Grund des Promotors PRM (RM = Repressor Maintenance) genügend CI als λ-Repressor vorhanden ist, werden die Promotoren PL und PR eines infizierenden Phagen sofort unterdrückt.

• Worauf beruht die Regulation der Genexpression am λ-switch?
Der Switch ist eine Stelle mit drei Operatoren. Die Repressoren Cro (Lyse) und CI (Lysogenie) binden gegenseitig an diese Operatoren und erniedrigen die Bindungsaffinität für den andern. Derjenige der das instabile Gleichgewicht auf seine Seite ziehen kann, gewinnt.

• Was ist lysogene Konversion?
Wenn Bakteriophagen ode Plasmide Virulenzgene für den Wirt übertragen.

• Weshalb eignen sich lysogene Bakteriophagen ideal als Vehikel für horizontalen Gentransfer?
Bakteriophagen können große DNA Fragmente übertragen und in rauhen Umweltbedingungen überleben.

VII Genexpression

• Eine Zelle kann ihre Stoffwechsel-Enzyme auf zwei Arten regulieren: über deren Synthese oder über deren Aktivität. Können Sie je ein Beispiel für diese beiden Mechanismen angeben? Was sind die Vorteile bzw. Nachteile dieser beiden Strategien?

• Können Sie erklären, weshalb in Bakterien die Expression von Genen für katabolische Enzyme meist über deren Induktion, jene von Genen für anabolische Enzyme meist über deren Repression gesteuert wird?

• Erklären Sie den Unterschied zwischen dem Lac-Repressor und dem Trp-Repressor im Bezug auf deren Wirkungsweise und allosterische Interaktion mit dem Effektor.

• Werden b-Galactosidase und Lac-Permease in Gegenwart oder Abwesenheit eines Induktors (IPTG) in einer Zelle mit folgendem diploiden Zustand gebildet: I+P-O+Z+Y+/I-P+O+Z+Y-?

• Aus welchem Grund wird das lac Operon in der Gegenwart von Glucose nicht abgelesen, auch wenn Lactose ebenfalls im Medium vorhanden ist? Welcher Mechanismus liegt diesem Phänomen zugrunde?

• Angenommen man mutiert die beiden Trp Codons (UGG) in der trp Leader Region (trpL) zu Gly Codons (GGG), wie wirkt sich das auf die Expression des trp Operons aus, wenn:
1.) Tryptophan im überschuss im Wachstumsmedium vorhanden ist oder
2.) wenn die Zelle unter Tryptophan- Mangel leidet?

VIII Restriktion / Modifikation

• Erklären Sie das Experiment der wirtskontrollierten Modifikation mit dem Bakteriophagen Lambda, und analysieren Sie es mit Hilfe Ihres Wissens über Restriktions/Modifikationssysteme.

• Weshalb eigene sich Restriktionsendonukleasen der Klasse II besonders für molekulargenetische Arbeiten? Weshalb nicht jene der Klassen I und III?

• Wovon hängt die Häufigkeit ab, mit welcher ein Restriktionsenzym ein bestimmtes DNA Molekül schneidet?

• Welche chemische Reaktion wird von DNA-Ligasen katalysiert? • Beschreiben Sie je eine positive und eine negative Selektionsstrategie, die bei
Klonierungsexperimenten mit Plasmidvektoren verwendet werden. • Was versteht man unter reverser Genetik?

IX Glossar

Allel
Eine von mehreren Formen eines Gens (Wildtype Allel, Mutanten Allel)

Auxotrophe Mutation
Auxotrophe Mutanten sind nicht mehr fähig ein bestimmtes Stoffwechselprodukt (z.B. Aminosäuren) zu synthetisieren und sind deshalb abhängig von dessen Zusatz im Wachstumsmedium.

Bakteriophagen
Viren, die Bakterien infizieren.

Chromosom
Doppelsträngiges DNA-Molekül, welches essentielle genetische Information trägt

Deletion
Löschung eines Basenpaares, führt zu einer Verschiebung des Translationsmechsnismus und mit einer Wahrscheinlichkeit von 1:21 zu einem Abbruch.

DnaA
Initiatorprotein für die → Replikation bei E. Coli. Erkennt und bindet an → OriC. Ermöglicht es den → Helicasen an diese Region zu binden.

DNA Poymerase

Expression
Kontrolliertes Abschreiben der genetischen Information und Übersetzen in Proteine.

Gelelektrophorese
In einem Gel werden die Proteine durch elektrische Wechselwirkung zur Ladungsquelle gezogen. Dabei werden die grossen Proteine im Gel stärker zurückgehalten, so dass eine Sortierung nach Grösse entsteht.

Gen
codierende Sequenz für ein Protein samt den Expressionssignalen (→ Start und → Stop-Codon)

Genom
gesamte genetische Information einer Zelle

Genotyp
Zustand des genetischen Materials, Allelzusammensetzung

Helicase
öffnet die Doppelhelix

Insertion
Einfügung eines Basenpaares, führt zu einer Verschiebung des Translationsmechsnismus und mit einer

Integron
Transposon, das gezielt Antibiotikaresistenzen einfängt. Wahrscheinlichkeit von 1:21 zu einem Abbruch.

Komplementation
Aufheben der phänotypische Auswirkung einer Mutation durch Beimischen einer zweiten Kopie des entsprechenden Gens (merodiploider Zustand). Zugegeben wird meist das entsprechende → Allel des Wildtyps.

konditionale Mutation
Der Phänotyp prägt sich nur unter bestimmten (permessivem oder restriktiven) Bedingungen aus. Beispiel: temperatursensitive Mutation.

Konjugation
"sexueller "Kontakt zwischen Bakterien. Dabei wird DNA getauscht. Kann nur von Bakterien mit den Ferilitets-Gen initiert werden.

Ligase
Verbindet die Okazakifragmente zu einem DNA-Strang

Lyse
Zerstörung der Plasmamembran einer Zelle und Freigabe des Cytoplasmas. Führt zum
Zelltod.

Lysogenie
Zustand eines Bakterium, das die DNA eines Virus inaktiv in sein Genom eingebaut hat. Das Virsu kann sich zugegebenem Zeitpunkt aktivieren und löst anschiessend die Zelle auf (→ Lyse)

Mutante Zelle (Organismus), die eine Mutation im Genom trägt

Mutation
Prozess, der zu vererbbarem (stabilem) veränderten Genom führt. Veränderte Stelle des Genoms, die aus diesem Prozess entstanden ist. Unterschieden wird bezüglich der Veränderung der DNA in → Punktmutation, → Deletion und → Insertion. Bezüglich der Auswirkung wird die → konditionale, die → auxotrophe und die → Resistenzmutation unterschieden.

mRNA
Eigentliche codierende RNA, welche in der Proteinsynthese abgelesen wird. Sie macht
etwa 5% aller RNA aus.

OriC
chromosomal origin of replication, Replikationsursprung

OriT
transferial origin of replication, Replikationsursprung bei horizontaler Replikation mittels
→ Konjunktion. ( σ -Replikation)

OriV
vegetative origin of replication, Replikationsursprung bei Plasmiden bei vertikaler
Replikation innerhalb des Wirtes. ( Θ -Replikation)

Phagen → Bakteriophagen

Phänotyp
äusseres Erscheinungsbild einer Zelle oder eines Individuums. Manifestation des
Genotyps

Plasmid
Kleines ringförmiges DNA-Molekül, das sich unabhängig vom Genom vermehrt.

Polymerasen
Enzyme, welche die Nucleotide zu einem DNA-Strang oder RNA-Strang
zusammenfügen.

Primase
Legt auf einer DNA-Matrize einen kurzen RNA-Strang an.

Primosom
Komplex aus → Primase und → Helicase auf dem Laggingstand zur
Effizienzsteigerung der Replikation.

Promotor
Nucleotidsequenz in der DNA an die die RNA-Polymerase bindet. Die
RNA-Polymerase erkennt diesen am Sigma-Faktor. Der Promotorbereich liegt -10 bis -35
Basenpaare vor dem Start der Gensequenz.

Punktmutation
Austausch eines Base Basenpaares. Führt zu stummer, neutraler, missens oder
nonsens Mutation.

Replikation
Exaktes Übertragen der genetischen Information auf Tochterzellen.

Resistenzmutation
verleihen Resistenz gegenüber einer toxischen Substanz (z.B. Antibiotika).

rRNA
Bildet die Ribosomen und macht ca. 80% der RNA in der Zelle aus.

Reversion
Rückmutation

Transduktion
Übertragung von Bakteriengenen eingebaut in virale DNA.

Transfromation
Aufnahme von freier DNA. Diese stammt z.B. aus abgestorbenen Zellen und
kann homolog rekombiniert erden.

Sigma-Faktor
Protein, welches die RNA-Polymerase benötigt um an einem → Promotor
anzudocken und die → Transkription in Gang zu setzen. Sobald ca. 10 Basenbaare
synthetisiert sind, wird der Sigmafaktor freigegeben und die Polymerase kommt erst
richtig in Gang. Verschiedene Sigma-Faktoren erkennen verschiedene Promotorsequenzen
und können so verschiedene Genfamilien ablesen.

SSB
Single stranded DNA binding protein. Bindet und stabilisiert einzelsträngige DNA.

Start-Codon
Sequenz AUG, selten GUG

Stop-Codon
Sequenzen UAA, UAG, UGA

Suppression
unabhängige 2. Mutation, die phänotypische Auswirkung einer ersten Mutation
ganz oder teilweise aufhebt

temperente Phagen
Phagen mit einem lysogenen Entwicklungszyklus. (Phagen DNA in
Wirts-DNa eingebettet)

Terminator
Signal auf Bakterien-DNA, das die → Transkription zum Halten bringt. Wird oft
aus einer Schleife in der DNA, gebildet durch zwei komplementäre Sequenzen gefolgt von
einigen A oder T. Diese sind schwächer bindend, da sie nur 2 H-Brücken aufweisen.

Topoisomerasen
Enzyme, die DNA Überspiralisierung einführen oder entfernen

Topoisomerasen I
Einzelstrangbrüche, entspannt superhelikale Aufwindungen

Topoisomerasen II
Doppelstrangbrüche, Energie-abhängig (ATP) führt superhelikale
Aufwindungen ein z.B. Gyrase: Einführen von negativer Überspiralisierung

Transkription
Ablesen eines einzelnen DNA-Strangs aus einer Doppelhelix und Sythese einer
komplementären RNA-Strangs durch → Polymerase. Abgelesen wird dabei der dem
codierende Strang gegenüberligende Matrizenstrang.

Transposons
"Springende Gene", sind ins Chromosom eingebaut und werden vertikal repliziert.

tRNA
kleine RNA-Moleküle, welche bei der Proteinsynthese als Adapter zwischen den
Aminosäuren und der mRNA verwendet werden. Machen ca. 15% der RNA in der Zelle
aus. Sie hat Kleeblattform mit einem Arm als Anticodon zum Aufsetzen auf der →
mRNA und einem Arm um die Aminosäure hinzuführen. Die Paarung der dritten Base
des Anticodon mit der mRNA ist weniger strikt, so dass weniger als 61 aber mehr als 20
tRNA in der Zelle existieren.

Wildtyp
unmutierte, ursprüngliche Allelform

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