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Biologie Leistungskurs Zusammenfassung: Genetischer Fingerabdruck und Mutationen

PCR-Technik:

PCR-Technik steht für polymerase chain reaction. Sie ist eine Methode zur Vervielfältigung einer bestimmten DNA-Sequenz. Aus jeder DNA kann so eine Nukleotidsequenz schnell amplifiziert (getrennt) werden. Die Technik ist ähnlich wie die Replikation. Hier wird jedoch nur ein bestimmter Teil der DNA repliziert (verdoppelt). Zur Durchführung benötigt man Primer, Nukleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) als Bausteine für die neu gebildete DNA und hitzestabile DNA-Polymerase als Enzyme.

1. Zuerst werden die oben genannten Stoffe in Wasser getan und auf ca. 95 Grad erhitzt. DNA-Doppelstrang wird gespalten. (Denaturierung)
2. Nach der Abkühlung auf ca. 60 Grad bindet der Primer an der DNA-Matrize. (Primer-Annealing)
3. Dann wird die Lösung noch einmal auf ca. 70 Grad erhitzt. DNA-Polymerase verdoppelt DNA bis die gewünschte Menge vorliegt. Diese Schritte werden 20-30 Mal wiederholt, bis die gewünschte Menge DNA-Menge vorliegt. (Elongation)

Sanger Sequenzierung:

Durch die Sanger Sequenzierung lässt sich die Nukleotid-Sequenz beliebiger DNA herausfinden. Diese Technik ermöglichte die Entschlüsselung des gesamten menschlichen Genoms.

1. Zunächst wird die DNA erhitzt und gespalten.
2. Danach setzt man wieder einen Primer (Enzym Primase), der an der Matrize bindet und die DNA-Synthese startet und dann die DNA-Polymerase, der die Synthese beschleunigt.
3. Dann werden geringe Mengen an Di-Desoxyribonukleotiden (Desoxyribose Zucker + Base) mit vier verschiedenen Basen hinzugegeben. Dies geschieht in vier verschiedenen Ansätzen. Im ersten befindet sich ddATP, in den zweiten kommt ddTTP, in den den dritten ddCT und in den vierten kommt ddGTP. Sie müssen künstlich hergestellt werden.
4. Wenn diese in die normale DNA eingebaut werden, kommt es zum Kettenabbruch bei der Synthese. Das geschieht mit einer Wahrscheinlichkeit von 10%.
5. Dadurch entstehen unterschiedlich lange Ketten. Die vier Versuchsansätze werden nun nebeneinander auf ein Träger-Gel aufgetragen und die DNA-Fragmente elektrophorisch ihrer Größe nach getrennt. Da die längeren Stücke langsamer als die die kürzeren Stücke sich im Gel bewegen, kann man die Sequenz am Ende einfach ablesen. Dadurch werden die Stränge encodiert.

Gelelektrophorese:

Um Fragmente der Größe nach zu ordnen, nutzt man die Gelelektrophorese:

1. Dazu wird das Polysaccharid Agarose in einer Lösung erhitzt und flüssig in die Elektrophoresekammer gegeben. Nach dem Abkühlen entsteht ein Gel.
2. Dann wird eine Pufferlösung mit Ionen in die Kammer getan, damit durch sie elektrischer Strom fließen kann. An beiden Kammerenden befinden sich Elektroden, um die Stromversorgung herzustellen.
3. Die DNA-Proben werden an der Kathode in kleine Taschen im Gel gefüllt.
4. Durch negative Ladungen wandern die DNA-Fragmente an die gegenüberliegende Seite zur Anode. Die verschiedenen Moleküle wandern aufgrund ihrer Eigenschaften auf dem Gel mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Die Wanderungsgeschwindigkeit eines Moleküls hängt von seiner Größe, Form und der vorhandenen Spannung ab.

Künstliche DNA-Rekombination:

- Plasmide sind Sequenzen auf der DNA, die die Enzyme, die benötigt werden um TNT Trinitrotoluol abzubauen herzustellen.
- Restriktionsenzyme: Bakterien verfügen über DNA-spaltende Enzyme, die Restriktionsendonukleasen. Sie können eingedrungene Viren-DNA in einzelne Stücke zerlegen.
- Dadurch können Gene gezielt aus ihrem Herkunftsgenom isoliert werden und in andere DNA eingebaut werden.

Vektoren:

- Plasmide können DNA-Abschnitte in Bakterienzellen einschleusen. Genfähren
- Bakterielle Plasmidvektoren haben den Vorteil, dass sie nur eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym haben. Man braucht die Schnittstelle nicht suchen, Man braucht nur einen Primer/eine Primase, man weiß direkt wo man ansetzen muss
- Sie können sich in der Wirtszelle replizieren. (Verdoppeln)
- Viele Kopien werden von der rekombinanten DNA gebildet und an die Tochterzellen weitergegeben.
- Übertragung ist auf 6-7 Kilobasenpaare beschränkt.
- Um größere DNA-Fragmente zu klonieren (bis zu 25 Basenpaare) nutzt man Bakteriophagen.

Wie entstehen Mutationen?

Man unterscheidet zwischen Spontanen und Induzierten Mutationen.

Spontane Mutationen:

• Entstehen durch Fehler bei bestimmten molekularen Mechanismen z.B. werden falsche Nukleotide in den neuen DNA-Strang eingebaut.
• Entstehen u.a. durch Tautomerie d.h., dass beispielsweise Cytosin von der üblichen Aminoform in die seltenere Iminoform wechselt und damit ihre
• Paarungseigenschaften verändert.

Induzierte Mutationen:

• UV-Strahlung
• Röntgen- und radioaktive Strahlung
• Basenanaloga (Ähneln sich in ihrer chemischen Struktur so sehr mit einer der vier Basen, dass es sein kann, dass die Substanz während der Replikation in die DNA eingebaut wird. Bsp. 5-Bromuracil ähnelt Thymin und kann sich deshalb mit Adenin paaren.
• Interkalierende Substanzen: Fügen sich zwischen Basenpaare und sorgen für Replikationsfehler und Leserastermutationen
• Alkylierende Mutagene: Alkylgruppen lagern sich an die Phosphatgruppen der DNA Veränderung der Basenstruktur, die zu einem Basenaustausch führen.

Klausurrelevante Themen:
- DNA Reparatur
- DNA Endverknüpfung
- Krebs Tumor Zykluskontrolle
- Vektoren, Restriktionsenzyme
- Genexpression

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